唾液酸分析的重要性

唾液酸是在聚糖的非還原末端發(fā)現(xiàn)的帶負(fù)電的單糖。它們對糖蛋白的穩(wěn)定性和3D構(gòu)象很重要，并參與許多生物相互作用。唾液酸通常具有關(guān)鍵的功能影響：例如，IgG上N-聚糖的唾液酸化增加了抗炎活性；O-乙酰化唾液酸可改變配體相互作用并影響降解（在EPO上發(fā)現(xiàn)O-乙酰基化唾液酸，包括Neu5,9Ac2）；唾液酸的存在還通過阻止位于肝細(xì)胞上的無唾液酸糖蛋白受體的攝取而增加糖蛋白的血清半衰期。

自然界中發(fā)現(xiàn)了多種唾液酸，但生物制藥中N-聚糖和O-聚糖上發(fā)現(xiàn)的兩種主要唾液酸是N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac，或NANA）和N-甘氨酸（Neu5Gc，或NAGA）。人類無法合成Neu5Gc，其在藥物中的存在可能導(dǎo)致免疫反應(yīng)，如慢性炎癥。已在正常人血清中檢測到抗Neu5Gc抗體，可中和任何含Neu5Gc的生物藥物，從而降低藥物的療效。重要的是要意識到，細(xì)胞系的選擇可以極大地影響生物制藥上存在的唾液酸類型，例如，小鼠IgG上的大部分唾液酸通常是Neu5Gc。

因此，為了藥物的安全性和有效性，必須在產(chǎn)品生命周期的所有階段監(jiān)測唾液酸的水平和類型，以及QC批次間的一致性。因此，唾液酸分析是ICH Q6B生物制藥特征描述指南中規(guī)定的監(jiān)管要求。

 

使?套件和標(biāo)準(zhǔn)可以獲得的信息

• 唾液酸（Neu5Ac和Neu5Gc）的定量為nmol/mg蛋白質(zhì)

• O-乙酰化Neu5,9AC2的相對定量

使?試劑盒和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行唾液酸定量分析

唾液酸的釋放

唾液酸通過糖蛋白樣品的溫和酸水解釋放； 通常從一式三份 50 μg 開始，盡管對于唾液酸化水平非常低的樣品可能需要更大的量，例如 單克隆抗體。 我們建議在整個過程中也采取一些過程控制：樣品緩沖液或水作為陰性對照； 胎球蛋白糖蛋白和/或定量糖肽作為陽性對照。 樣品和過程控制與 2M 乙酸在 80°C 下孵育 2 小時。

 

DMB 標(biāo)簽

為了實現(xiàn)靈敏檢測，釋放的唾液酸隨后用 1,2-二氨基-4,5-亞甲二氧基苯.2HCl (DMB) 進(jìn)行熒光標(biāo)記 - 見圖 1。當(dāng)唾液酸環(huán)打開時，它會在羧酸旁邊暴露一個酮基 ，DMB 結(jié)合這兩個相鄰的酮基產(chǎn)生熒光團(tuán)（其他單糖沒有這些相鄰的酮基，因此它們沒有熒光標(biāo)記）。 酸水解樣品和過程控制加上 Ludger 唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品：Neu5Ac (B491176)、Neu5Gc (B491217)、唾液酸參考組 (S491526) 和 Neu5,9Ac2 (N491192)（如果使用）與 DMB 在 50°C 下孵育 3 小時。

 

液相色譜分析

稀釋 Neu5Ac 和 Neu5Gc 標(biāo)準(zhǔn)品以生成用于定量這兩種唾液酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 唾液酸參考面板 (S491526) 和 Neu5,9Ac2 用于唾液酸鑒定

 

液相色譜條件

溶劑 A = 乙腈:甲醇:水 9:7:84

溶劑 B = 乙腈

熒光：激發(fā)?：373 nm； 發(fā)射 ?: 448 nm

柱溫 = 30°C； 樣品溫度 = 10°C

 

 

結(jié)果

將樣品中 Neu5Ac 和 Neu5Gc 的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，以提供樣品和過程控制中唾液酸含量的定量數(shù)據(jù)。 圖 2 顯示了從小鼠和人類 IgG 釋放的唾液酸數(shù)據(jù)。 小鼠 IgG 具有高水平的非人唾液酸 Neu5Gc，在這種情況下，人 IgG 的唾液酸是小鼠 IgG 的 4 倍。 圖 3 顯示了 EPO 中唾液酸的數(shù)據(jù)。 Neu5Ac 和 Neu5Gc 的絕對量可以通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來確定。 然而，EPO 也含有 O-乙酰化唾液酸 Neu5,9Ac2。 在水性條件下，9 位的乙酸鹽可以遷移到 8 位，因此很難對 Neu5,9Ac2 進(jìn)行完全定量的標(biāo)準(zhǔn)品。 因此，唾液酸通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間進(jìn)行比較來確定，Neu5Ac、Neu5Gc 和 Neu5,9Ac2 的相對比例由它們的峰面積確定。

 

圖 2：小鼠和人類 IgG 中 Neu5Ac 和 Nue5Gc 的鑒定和定量。

 

圖 3：EPO 中唾液酸的鑒定和定量。